研究發(fā)現(xiàn)，TRIM59基因在肝癌細胞中存在異常表達，可用于原發(fā)性肝癌的早期診斷。TRIM59蛋白含有R、B、C和TM四個功能區(qū)，如圖1所示；科研人員采用一定的技術手段，獲得了TRIM59基因的cDNA，分別構(gòu)建TRIM59基因過表達及TRIM59基因敲除質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染肝癌細胞株后，過表達及敲減細胞株的增殖情況如圖2所示。

（1）圖2的實驗結(jié)果表明

在肝癌細胞系中，敲除TRIM59可以有效抑制細胞的增殖能力，過表達TRIM59細胞的增殖能力顯著增加

在肝癌細胞系中，敲除TRIM59可以有效抑制細胞的增殖能力，過表達TRIM59細胞的增殖能力顯著增加

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（2）科研人員通過PCR擴增了圖1中4種不同長度的蛋白質(zhì)功能區(qū)組合片段所對應的TRIM59基因片段，并插入圖3所示的帶FLAG標簽序列（27bp）的載體中，與FLAG標簽序列形成融合基因。FLAG是一種短肽，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響TRIM59蛋白功能區(qū)的功能。
PCR擴增4種不同長度TRIM59基因片段需要的引物有

5

5

種；為了使目的基因正確插入，除△R對應的TRIM59基因片段以外，在目的基因上游引物的5′端應插入

BamHⅠ

BamHⅠ

（“BamHⅠ”或“EcoRⅠ”）的識別序列，理由是

使用EcoRⅠ會導致載體移碼突變，翻譯出的氨基酸序列改變

使用EcoRⅠ會導致載體移碼突變，翻譯出的氨基酸序列改變

；可利用PCR技術驗證融合基因是否構(gòu)建成功，其實驗思路是

以插入FLAG-目的基因的載體為模板，使用載體引物F和目的基因下游引物進行PCR擴增，電泳檢測是否擴增出DNA條帶，及對應的大小

以插入FLAG-目的基因的載體為模板，使用載體引物F和目的基因下游引物進行PCR擴增，電泳檢測是否擴增出DNA條帶，及對應的大小

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（3）體外實驗發(fā)現(xiàn)TRIM59蛋白和PPM1B蛋白有結(jié)合現(xiàn)象。為了研究兩蛋白在細胞內(nèi)是否結(jié)合，科研人員分別將FLAG-TRIM59（FL）質(zhì)粒、FLAG-TRIM59（R+B）質(zhì)粒、FLAG-TRIM59（R）質(zhì)粒、FLAG-TRIM59（△R）質(zhì)粒與帶有GFP標簽的GFP-PPM1B質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染受體細胞，以單獨轉(zhuǎn)染GFP-PPM1B質(zhì)粒的受體細胞作為對照。分別利用FLAG抗體和GFP抗體對①至⑤實驗細胞裂解液中的蛋白質(zhì)進行檢測，結(jié)果如圖4中膠片一、二所示。再利用GFP抗體對上述FLAG抗體免疫沉淀中的蛋白質(zhì)進行檢測，結(jié)果如膠片三所示。
圖中實驗結(jié)果說明

兩蛋白在細胞內(nèi)相互結(jié)合，TRIM59蛋白通過R結(jié)構(gòu)與PPM1B結(jié)合

兩蛋白在細胞內(nèi)相互結(jié)合，TRIM59蛋白通過R結(jié)構(gòu)與PPM1B結(jié)合

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（4）研究發(fā)現(xiàn)TRIM59蛋白的R功能區(qū)具有泛素化連接酶的活性，可介導泛素化途徑降解PPM1B蛋白，PPM1B能夠使某種蛋白去磷酸化進而抑制癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，據(jù)此可推測肝癌患者中TRIM59蛋白和PPM1B蛋白的量呈

負

負

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