基因敲除是通過(guò)一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失，從而使部分功能被屏蔽的技術(shù)。來(lái)源于λ噬菌體的Red同源重組系統(tǒng)由λ噬菌體的exo、bet、gam3個(gè)基因組成，分別編碼EXO、BET、GAM3種蛋白質(zhì)，可用于大腸桿菌等一系列工程菌的基因敲除。Red同源重組技術(shù)要用到質(zhì)粒pKD46，該質(zhì)粒含有溫度敏感型的復(fù)制起點(diǎn)oriR101，在30℃培養(yǎng)時(shí)可以正常復(fù)制，而高于37℃時(shí)會(huì)自動(dòng)丟失；由ParaB啟動(dòng)子調(diào)控的exo、bet、gam基因，需要L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)。λ-Red系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲除過(guò)程如圖所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）EXO為雙鏈核酸外切酶，可以結(jié)合在雙鏈DNA的末端，從5′向3′降解DNA單鏈，產(chǎn)生

3'

3'

（選填“3′或5′”）黏性末端；BET結(jié)合在EXO外切產(chǎn)生的末端單鏈上，促進(jìn)其與受體細(xì)胞的靶序列進(jìn)行同源重組，替換靶基因；GAM蛋白能夠抑制受體細(xì)胞內(nèi)核酸外切酶活性，進(jìn)而

抑制

抑制

（選填“抑制”或“促進(jìn)”）受體細(xì)胞對(duì)外源DNA的降解。
（2）要將pKD46導(dǎo)入大腸桿菌，首先需用Ca²⁺處理大腸桿菌，目的是

使其處于感受態(tài)

使其處于感受態(tài)

。為使pKD46在細(xì)菌內(nèi)正常復(fù)制、Red重組酶正常合成，必需滿(mǎn)足的培養(yǎng)條件是

培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)基中含L-阿拉伯糖

培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)基中含L-阿拉伯糖

。過(guò)程I是用含有青霉素的培養(yǎng)基篩選成功導(dǎo)入了pKD46的大腸桿菌，說(shuō)明

大腸桿菌不含青霉素抗性基因，pKD46中含青霉素抗性基因

大腸桿菌不含青霉素抗性基因，pKD46中含青霉素抗性基因

。
（3）用PCR技術(shù)擴(kuò)增卡那霉素抗性基因時(shí)，同時(shí)需考慮將大腸桿菌基因組DNA上特定靶基因敲除。圖中含HAⅠ的引物由兩部分組成，其中HAⅠ的堿基序列應(yīng)該與

靶基因外側(cè)

靶基因外側(cè)

的堿基序列相同，另一部分應(yīng)該與

卡那霉素抗性基因

卡那霉素抗性基因

相應(yīng)鏈上的堿基互補(bǔ)。
（4）為篩選出同源重組成功的大腸桿菌（靶基因被敲除），過(guò)程II使用的培養(yǎng)基必須含有

卡那霉素

卡那霉素

，然后再通過(guò)在

高于37℃

高于37℃

條件下培養(yǎng)，把質(zhì)粒pKD46除去。