為了研究低溫誘導(dǎo)對(duì)某基因的啟動(dòng)子P活性的影響，科研人員進(jìn)行了啟動(dòng)子P的PCR提取、特定表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因煙草的功能鑒定。該基因及其啟動(dòng)子P的結(jié)構(gòu)及相應(yīng)限制酶的切割位點(diǎn)如圖1所示，圖中灰色區(qū)域堿基序列是已知的，啟動(dòng)子P（圖中黑色區(qū)域）及上游堿基序列未知，片段Ⅰ和片段Ⅱ中的字母A～F均表示引物。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。

（1）啟動(dòng)子是

RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合

RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合

的位點(diǎn)。不能直接根據(jù)片段I擴(kuò)增啟動(dòng)子P的原因是

啟動(dòng)子P及左側(cè)的序列未知，無(wú)法合成PCR所需要的引物

啟動(dòng)子P及左側(cè)的序列未知，無(wú)法合成PCR所需要的引物

。
（2）為了能擴(kuò)增正常啟動(dòng)子P，科研人員先用

酶1和DNA連接

酶1和DNA連接

酶處理圖中的片段Ⅰ，使片段Ⅰ成為環(huán)狀DNA；再將環(huán)狀DNA用

酶2

酶2

（填“酶1”或“酶2”）處理得到了片段Ⅱ，如圖2所示。根據(jù)片段Ⅱ能不能擴(kuò)增出啟動(dòng)子P？若能，請(qǐng)寫(xiě)出可選用的引物組合（用C、D、E、F表示），若不能請(qǐng)說(shuō)明理由

能，可選用的引物組合是D和E

能，可選用的引物組合是D和E

。
（3）已知卡那霉素可抑制煙草細(xì)胞的生長(zhǎng)，基因M可在煙草的根部正常表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物可將X-Gluc水解生成藍(lán)色物質(zhì)。將啟動(dòng)子P和基因M結(jié)合并與含有卡那霉素抗性基因的Ti-質(zhì)粒重組構(gòu)建基因表達(dá)載體。將表達(dá)載體和酚類(lèi)物質(zhì)混合后加入含有煙草細(xì)胞的培養(yǎng)基中，酚類(lèi)物質(zhì)的作用是

吸引農(nóng)桿菌感染煙草細(xì)胞

吸引農(nóng)桿菌感染煙草細(xì)胞

。再用含有

卡那霉素和X?Gluc

卡那霉素和X?Gluc

的培養(yǎng)基篩選出所需的煙草細(xì)胞，然后經(jīng)過(guò)植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。