大多數(shù)奶酪的生產(chǎn)需要使用凝乳酶來凝聚固化奶中的蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)的制備凝乳酶的方法是通過殺死未斷奶的小牛，然后將它的第四胃的黏膜取出來進(jìn)行提取，此法已不再使用?，F(xiàn)在科學(xué)家將編碼牛凝乳酶的基因（長度1.5 kb）導(dǎo)入大腸桿菌獲得工程菌，再通過工業(yè)發(fā)酵批量生產(chǎn)凝乳酶。圖1為所用載體示意圖，表為限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)。請回答下列問題：

限制酶	識(shí)別序列
HindⅡ	A↓AGCTT
Pvit2	CAG↓CTG
KpnⅠ	G↓GTACC
EcoRⅠ	G↓AATTC
PstⅠ	CTGC↓AG
BamHⅠ	G↓GATCC

（1）獲取牛凝乳酶基因：提取小牛胃黏膜組織中的

總RNA

總RNA

，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到

cDNA

cDNA

，將其作為PCR反應(yīng)的模板，并依據(jù)

牛凝乳酶基因兩端的核苷酸序列

牛凝乳酶基因兩端的核苷酸序列

，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物來擴(kuò)增目的基因。
（2）構(gòu)建基因表達(dá)載體：為使目的基因與載體正確連接，在擴(kuò)增目的基因時(shí)，應(yīng)在其一對(duì)引物的

5′

5′

端分別引入

Pvit2和EcoRⅠ

Pvit2和EcoRⅠ

兩種不同限制酶的識(shí)別序列。在目的基因和載體連接時(shí)，可選用

T₄DNA連接酶

T₄DNA連接酶

（填“E.coli DNA連接酶”或“T₄ DNA連接酶”）。
（3）轉(zhuǎn)化：先用

CaCl₂（Ca²⁺）

CaCl₂（Ca²⁺）

溶液處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于

感受態(tài)

感受態(tài)

的生理狀態(tài)，以提高轉(zhuǎn)化效率。
（4）篩選與鑒定：將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含

氨芐青霉素

氨芐青霉素

的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取菌落（分別編號(hào)為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用（2）中選用的兩種限制酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，結(jié)果如圖2，

2

2

號(hào)菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。
注：M為指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物；小于0.2 kb的DNA分子條帶未出現(xiàn)在圖2中。
（5）發(fā)酵工程生產(chǎn)凝乳酶：發(fā)酵工程需要對(duì)選育的工程菌菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，從物理性質(zhì)上，一般選

液體

液體

培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)酵過程的中心環(huán)節(jié)是

（發(fā)酵罐）發(fā)酵

（發(fā)酵罐）發(fā)酵

，必須嚴(yán)格控制好發(fā)酵條件，以便獲得更多的發(fā)酵產(chǎn)品。