某研究小組利用水稻細胞培育能產(chǎn)生HPV（人乳頭瘤病毒）-LI蛋白的水稻胚乳細胞生物反應(yīng)器，為獲得HPV-L1蛋白提供一種新的高效、低廉的途徑，用于制備HPV疫苗。其基本流程包括表達載體的構(gòu)建、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、水稻細胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因植株的篩選等步驟，最終獲得能產(chǎn)生含HPV-L1蛋白胚乳細胞的轉(zhuǎn)基因水稻?；卮鹣铝袉栴}：
（1）目的基因的獲?。焊鶕?jù)研究目標，科研人員可以從

基因文庫

基因文庫

釣取HPV-L1基因，或者也可以分析HPV-L1蛋白的氨基酸序列，經(jīng)

化學(xué)方法合成

化學(xué)方法合成

得到目的基因，隨后，在合成基因的兩端分別引入MlyⅠ和XhoⅠ酶切位點，目的基因兩端設(shè)置不同酶切位點的目的是

使目的基因定向插入，減少自身環(huán)化，以便其正確轉(zhuǎn)錄和表達

使目的基因定向插入，減少自身環(huán)化，以便其正確轉(zhuǎn)錄和表達

。PCR是獲取HPV-L1基因的一種方法，PCR反應(yīng)體系設(shè)計的兩種引物，在引物間和引物內(nèi)的堿基都不能互補，其原因是

防止引物內(nèi)或引物間結(jié)合形成雙鍵，導(dǎo)致引物與DNA模板結(jié)合效率降低

防止引物內(nèi)或引物間結(jié)合形成雙鍵，導(dǎo)致引物與DNA模板結(jié)合效率降低

。
（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：科研人員構(gòu)建了如圖所示的表達載體，將其與經(jīng)

氯化鈣

氯化鈣

處理成感受態(tài)的農(nóng)桿菌細胞混合，并控制溫度進行

液體懸浮

液體懸浮

培養(yǎng)，完成轉(zhuǎn)化和細胞復(fù)蘇，隨后將菌液涂布在含

卡那霉素

卡那霉素

的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取菌落進行PCR鑒定后再擴大培養(yǎng)待用。
（3）水稻細胞轉(zhuǎn)化：取水稻種子脫殼后經(jīng)

消毒

消毒

處理，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中發(fā)生

脫分化

脫分化

過程形成愈傷組織。挑取生長良好的愈傷組織加入到（2）中得到菌液中共培養(yǎng)，完成轉(zhuǎn)化過程。為提高轉(zhuǎn)化效率，下列措施中可以采用的是哪幾項？

AC

AC

。
A.不時搖動培養(yǎng)液
B.縮短培養(yǎng)時間
C.控制菌液中農(nóng)桿菌濃度
D.降低培養(yǎng)溫度
（4）轉(zhuǎn)基因水稻的篩選：將轉(zhuǎn)化處理后的水稻愈傷組織放在含抗生素的培養(yǎng)基中除菌處理后，轉(zhuǎn)移至含有

潮霉素

潮霉素

的固體選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并誘導(dǎo)出

根和芽分生組織或胚狀體

根和芽分生組織或胚狀體

，繼續(xù)培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)基因水稻。
（5）為了檢測是否成功導(dǎo)入HPV-L1基因并培育出能產(chǎn)生HPV-L1蛋白的水稻胚乳細胞生物反應(yīng)器，請完善以下實驗思路：
Ⅰ.分別提取純化

胚乳細胞

胚乳細胞

的總DNA和蛋白質(zhì)，經(jīng)處理后分別固定在硝酸纖維素膜上。
Ⅱ.讓待測DNA與HPV-L1基因探針發(fā)生

核酸分子雜交

核酸分子雜交

，放射自顯影檢測以確定目的基因已經(jīng)成功導(dǎo)入。
Ⅲ.讓待測蛋白質(zhì)與

放射性HPV-L1蛋白抗體發(fā)生抗原-抗體雜交

放射性HPV-L1蛋白抗體發(fā)生抗原-抗體雜交

，放射自顯影檢測以確定目的基因已經(jīng)成功表達。