纖維二糖酶可以將纖維二糖分解成葡萄糖和其他單糖。將來源于黑曲霉的纖維二糖酶基因 （CB） 和強(qiáng)啟動子Pcbh1、終止子Tcbh1構(gòu)建成重組質(zhì)粒，獲得了高效表達(dá)纖維二糖酶的里氏木霉優(yōu)勢菌株。請回答下列問題：
（1）科研人員利用PCR擴(kuò)增黑曲霉的CB，請完成表格。

PCR項(xiàng)目	相關(guān)操作
緩沖液	PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加① Mg2+ Mg2+
模板、引物、原料和酶	提供DNA模板、2種引物、dNTP和Taq酶
反應(yīng)過程	每次循環(huán)依次分為② 變性、復(fù)性和延伸 變性、復(fù)性和延伸 三步
循環(huán)次數(shù)	一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)
產(chǎn)物鑒定	常采用③ 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳 方法來鑒定PCR的產(chǎn)物

（2）為將CB以正確方向插入質(zhì)粒需要雙酶切。已知CB的α鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，應(yīng)在圖1中引物

2

2

的

5'

5'

端加入EcoRⅠ的識別序列，理由是

a鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，該鏈在強(qiáng)啟動子PcbhI后的方向應(yīng)為3'→5’，因此引物2應(yīng)位于CB的上游，為使子鏈從引物2的3’端延伸，其5’端應(yīng)構(gòu)建EcoRI的酶切位點(diǎn)

a鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，該鏈在強(qiáng)啟動子PcbhI后的方向應(yīng)為3'→5’，因此引物2應(yīng)位于CB的上游，為使子鏈從引物2的3’端延伸，其5’端應(yīng)構(gòu)建EcoRI的酶切位點(diǎn)

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（3）為研究磷脂酶（PLC-E）與纖維二糖酶基因表達(dá)的關(guān)系，研究者構(gòu)建了高效沉默PLC-E基因的反向雙啟動子載體，如圖3所示，其中TrpC和 Rp2為啟動子，eGFP為增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因，eGFP的作用是

篩選

篩選

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實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測和分析：
①轉(zhuǎn)基因里氏木霉菌無綠色熒光，說明PLC-E基因沉默，其機(jī)理是

在雙啟動子作用下，轉(zhuǎn)錄形成的兩種RNA互補(bǔ)，產(chǎn)生雙鏈RNA，抑制翻譯，達(dá)到eGFP與PLC-E基因同時沉默的效果

在雙啟動子作用下，轉(zhuǎn)錄形成的兩種RNA互補(bǔ)，產(chǎn)生雙鏈RNA，抑制翻譯，達(dá)到eGFP與PLC-E基因同時沉默的效果

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②與野生型相比，轉(zhuǎn)基因里氏木霉菌的纖維二糖酶含量顯著降低，說明

磷脂酶促進(jìn)纖維二糖酶基因的表達(dá)

磷脂酶促進(jìn)纖維二糖酶基因的表達(dá)

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