紅景天中的HMA3基因能編碼Cd轉運蛋白。科研人員將紅景天中的HMA3基因轉入欒樹，以實現欒樹的定向改良，使其增強對Cd的富集能力，從而更有效治理Cd污染。實驗的主要流程如圖，其中Hyg^r為潮霉素抗性基因，Kan^r為卡拉霉素抗性基因。下表為限制酶的識別序列和切割位點。請回答下列問題。

EcoRⅠ	BamHⅠ	HindⅢ	Sau3AⅠ	BglⅡ	XbaⅠ
G↓AATTC	G↓GATCC	A↓AGCTT	↓GATC	A↓GATCT	T↓CTAGA

（1）重組質粒的構建、擴增、保存：
①從紅景天細胞中提取總RNA為模板，進行RT-PCR，該過程需要加入的酶有

耐高溫的DNA聚合酶和逆轉錄酶

耐高溫的DNA聚合酶和逆轉錄酶

。PCR過程中在循環(huán)前常要進行一次94℃、5min預變性，其目的是

增加模板DNA徹底變性的概率（使模板DNA充分變性）

增加模板DNA徹底變性的概率（使模板DNA充分變性）

。
②據以上圖表分析，為構建Cd轉運蛋白與綠色熒光蛋白（GFP）的融合蛋白，進行PCR擴增HMA3基因時需要在引物的5′端添加限制酶

BglⅡ和HindⅢ

BglⅡ和HindⅢ

的識別序列，以確保目的基因與質粒正確連接。至少需要

3

3

個循環(huán)才能獲得預期的基因。若模板HMA3基因的數量為a個，進行35個循環(huán)后，產物中同時含有兩種引物的DNA有

（2³⁵-2）a

（2³⁵-2）a

個。
③通過DNA連接酶進行連接制備重組質粒，并依次轉入大腸桿菌和農桿菌。其中將重組質粒轉入大腸桿菌的主要目的是

讓其在大腸桿菌中復制、保存

讓其在大腸桿菌中復制、保存

（2）欒樹愈傷組織的誘導：
切割無菌苗將其莖段插入愈傷組織培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應添加

細胞分裂素和生長素

細胞分裂素和生長素

（填植物激素的名稱），放入培養(yǎng)箱，經過21d的黑暗誘導，形成愈傷組織。
（3）農桿菌介導轉化體系的建立：
將農桿菌單克隆菌株對欒樹愈傷組織進行侵染轉化，并用添加

潮霉素

潮霉素

的培養(yǎng)基篩選出轉化成功的愈傷組織，將愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)成完整植株。
（4）原生質體制備及目的基因的檢測和鑒定：
①取4g篩選后愈傷組織，用鑷子輕輕搗碎，沖洗。用濾網過濾溶液，將愈傷組織轉移至含

纖維素酶和果膠酶

纖維素酶和果膠酶

的酶解液中處理一段時間獲得原生質體。
②在激光共聚焦下觀測到細胞膜發(fā)出綠色熒光。在本研究中選擇GFP與Cd轉運蛋白構建融合蛋白的目的是

通過觀察綠色熒光來確定Cd轉運蛋白是否表達以及分布場所

通過觀察綠色熒光來確定Cd轉運蛋白是否表達以及分布場所

?？茖W家們已通過蛋白質工程技術制造出了藍色熒光蛋白，正確的順序是

②①③④

②①③④

（用下列序號表示）。
①推測藍色熒光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
②藍色熒光蛋白的功能分析和結構設計
③藍色熒光蛋白基因的修飾（合成）
④表達出藍色熒光蛋白