基因敲除是通過一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)?？茖W(xué)家常借助基因敲除技術(shù)，使特定的基因功能喪失，從而使部分功能被屏蔽，并可進(jìn)一步對(duì)生物體造成影響，進(jìn)而推測(cè)出該基因的生物學(xué)功能。來源于λ噬菌體的Red同源重組系統(tǒng)就可用于大腸桿菌等一系列工程菌的基因敲除。
（1）Red同源重組由λ噬菌體的exo、bet、gam3個(gè)基因組成，分別編碼EXO、BET、GAM3種蛋白質(zhì)，EXO為雙鏈核酸外切酶，可以結(jié)合在雙鏈DNA的末端，產(chǎn)生3′黏性末端；BET結(jié)合在EXO外切產(chǎn)生的末端單鏈上，促進(jìn)其與受體細(xì)胞內(nèi)正在復(fù)制的靶序列進(jìn)行同源重組，替換靶基因；GAM蛋白能夠抑制受體細(xì)胞內(nèi)核酸外切酶活性，進(jìn)而

抑制

抑制

（選填“抑制”或“促進(jìn)”）受體細(xì)胞對(duì)外源DNA的降解。
（2）Red同源重組技術(shù)要用到質(zhì)粒pKD46，該質(zhì)粒含有溫度敏感型的復(fù)制起點(diǎn)oriR101，在30℃培養(yǎng)時(shí)可以正常復(fù)制，而高于37℃時(shí)會(huì)自動(dòng)丟失；還有由ParaB啟動(dòng)子調(diào)控的exo、bet、gam基因，需要L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)。λ-Red系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲除過程如圖所示。
①將pKD46導(dǎo)入處于

感受態(tài)

感受態(tài)

（某種狀態(tài)）的大腸桿菌，為使pKD46在細(xì)菌內(nèi)正常復(fù)制、Red重組酶正常合成，必需滿足

培養(yǎng)溫度為30℃，且培養(yǎng)基中含L-阿拉伯糖

培養(yǎng)溫度為30℃，且培養(yǎng)基中含L-阿拉伯糖

的培養(yǎng)條件。過程I是用含有青霉素的培養(yǎng)基篩選成功導(dǎo)入了pKD46的大腸桿菌，這說明

實(shí)驗(yàn)用大腸桿菌不含青霉素抗性基因（或在含青霉素培養(yǎng)基中不能存活）且pKD46質(zhì)粒含有青霉素抗性基因

實(shí)驗(yàn)用大腸桿菌不含青霉素抗性基因（或在含青霉素培養(yǎng)基中不能存活）且pKD46質(zhì)粒含有青霉素抗性基因

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②用PCR技術(shù)擴(kuò)增卡那霉素抗性基因，將獲得的線性DNA片段導(dǎo)入大腸桿菌，通過同源重組將大腸桿菌基因組DNA上的特定靶基因敲除。
③為篩選出同源重組成功（即靶基因被敲除）的大腸桿菌，過程II所用的培養(yǎng)基必需含有

卡那霉素

卡那霉素

；然后在

高于37℃的溫度下培養(yǎng)

高于37℃的溫度下培養(yǎng)

，把質(zhì)粒pKD46除去。
④Red同源重組技術(shù)要用到質(zhì)粒pKD46，該質(zhì)粒含有ParaB啟動(dòng)子，負(fù)責(zé)調(diào)控exo、bet、gam基因，ParaB啟動(dòng)子的作用是

是RNA聚合酶識(shí)別及結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)exo、bet、gam基因轉(zhuǎn)錄出mRNA

是RNA聚合酶識(shí)別及結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)exo、bet、gam基因轉(zhuǎn)錄出mRNA

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