人體肝臟細胞中的乙醛脫氫酶2（ALDH2）是人體酒精代謝中的關(guān)鍵酶。研究人員利用定點誘變技術(shù)對ALDH2基因進行改造后在大腸桿菌中表達，獲得具有較好溶解性的乙醛脫氫酶2。所用質(zhì)粒和操作過程如圖。其中，Amp^r為氨芐青霉素抗性基因，Tet^r為四環(huán)素抗性基因。質(zhì)粒的外側(cè)鏈為a鏈，內(nèi)側(cè)鏈為b鏈?；駻mp^r轉(zhuǎn)錄的模板鏈屬于a鏈的片段。改造后的ALDH2基因編碼區(qū)首端到末端（其中一條鏈）的序列為5′-ATCCATGCGCTC…（中間核苷酸序列）CAGTGAGTAGCG-3′。四種限制酶的識別序列及切割位點見下表。請回答下列問題：

限制酶	BamHⅠ	PstⅠ	XhoⅠ	XbaⅠ
識別序列和切割位點（5′→3′）	G↓GATCC	C↓TGCAG	C↓TCGAG	T↓CTAGA

（1）通過定點誘變技術(shù)可制備自然界原本

不存在

不存在

（選填“存在”或“不存在”）的蛋白質(zhì)。
（2）質(zhì)粒復(fù)制的模板鏈是

a和b

a和b

（選填“a”、“b”、“a和b”、“a或b”）鏈，基因Tet轉(zhuǎn)錄的模板鏈屬于

b鏈

b鏈

的片段。若用Xh0I切割質(zhì)粒后，形成的單鏈末端堿基序列為

TCGA—

TCGA—

。
（3）過程②需要的酶是

限制酶（或BamHⅠ、XabⅠ）和DNA連接酶

限制酶（或BamHⅠ、XabⅠ）和DNA連接酶

。過程③常采用

CaCl₂

CaCl₂

處理以提高操作效果。經(jīng)過程④，在培養(yǎng)基上能形成菌落的大腸桿菌類型有

導(dǎo)入空白質(zhì)粒的和導(dǎo)入重組質(zhì)粒的

導(dǎo)入空白質(zhì)粒的和導(dǎo)入重組質(zhì)粒的

。
（4）為擴增目的基因，某同學(xué)設(shè)計了如下六種PCR引物，其中可選用（符合題意）的一對引物是

②⑤

②⑤

（選填數(shù)字序號）。根據(jù)選定的引物，至少需經(jīng)過

6

6

次循環(huán)，可獲得32個符合要求的目的基因。
①5′-TCTAGAATCCATGCGCTC-3′
②5′-TCTAGACGCTACTCACTG-3′
③5′-CTGCAGATCCATGCGCTC-3′
④5′-GGATCCCGCTACTCACTG-3′
⑤5′-GGATCCATCCATGCGCTC-3′
⑥5′-CTCGAGCGCTACTCACTG-3′