Cre/loxP重組酶系統(tǒng)是對(duì)轉(zhuǎn)基因受體細(xì)胞DNA上的特定序列進(jìn)行定點(diǎn)切割和重新連接，從而在基因或染色體水平上對(duì)生物基因進(jìn)行遺傳改造的一種技術(shù)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）loxP具有方向性，結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中決定方向的序列是

②

②

（填序號(hào)）。
（2）Cre酶能催化如圖2所示的反應(yīng)，隨機(jī)識(shí)別DNA分子上同向排列的兩個(gè)相同的loxP序列并在圖1的②中特定位點(diǎn)切斷DNA雙鏈，切口被重新連接后，保留片段

2

2

，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的敲除。若經(jīng)Cre酶作用使得2個(gè)loxP位點(diǎn)間的序列發(fā)生反轉(zhuǎn)，其原因可能是

兩個(gè)loxP序列方向相反

兩個(gè)loxP序列方向相反

。
（3）Cre/loxP重組酶系統(tǒng)可以調(diào)控基因的表達(dá)，在目的基因

上游

上游

（填“上游”或“下游”）插入一個(gè)帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)的編碼終止密碼子的序列，在Cre酶存在的情況下，目的基因

表達(dá)

表達(dá)

（填“表達(dá)”或“不表達(dá)”）。
（4）在轉(zhuǎn)基因煙草的制備過(guò)程中，通常用

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

法把攜帶抗蟲(chóng)基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入煙草細(xì)胞，經(jīng)檢測(cè)導(dǎo)入成功后，標(biāo)記基因如抗除草劑基因即失去用途，可用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)將標(biāo)記基因敲除，其繼續(xù)留在煙草體內(nèi)可能會(huì)引發(fā)的生物環(huán)境安全問(wèn)題是

抗除草劑基因可能轉(zhuǎn)移到雜草中，造成基因污染

抗除草劑基因可能轉(zhuǎn)移到雜草中，造成基因污染

。
（5）GUS基因編碼的酶可將無(wú)色底物生成藍(lán)色產(chǎn)物，GFP基因會(huì)產(chǎn)生綠色熒光蛋白，這兩種基因都可作為標(biāo)記基因，配合Cre/loxP重組酶系統(tǒng)來(lái)研究發(fā)育生物學(xué)的問(wèn)題。

①構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，可用

限制酶和DNA連接

限制酶和DNA連接

酶將loxP序列、GUS基因及GFP基因連接，接上35S啟動(dòng)子之后可在組織中檢測(cè)出藍(lán)色區(qū)而無(wú)綠色熒光區(qū)（如圖3所示），這是由于

GFP

GFP

基因自身無(wú)啟動(dòng)子而無(wú)法表達(dá)。
②Cre基因經(jīng)38℃熱處理后可被激活表達(dá)，在此前提下組織中可檢測(cè)出綠色熒光區(qū)，據(jù)此分析綠色熒光區(qū)形成的原因是

Cre重組酶能（特異性識(shí)別并）切割loxP序列，使GFP基因得以表達(dá)

Cre重組酶能（特異性識(shí)別并）切割loxP序列，使GFP基因得以表達(dá)

，采用

延長(zhǎng)熱處理時(shí)間

延長(zhǎng)熱處理時(shí)間

等手段可以擴(kuò)大組織中綠色熒光區(qū)的面積。